Курсова робота - Мала ядерна РНК

1.doc (1 стор.)
Оригінал


Московський Державний Педагогічний Університет

Біолого-хімічний факультет


Курсова робота з біохімії на тему:

«Мала ядерна РНК».


Виконала студентка

3 курсу, 4гр., 9 п / гр.,

Суходольська Євгенія.

Науковий керівник:

Проф. Єгорова Т. А.


Москва, 2009

Зміст.





Введення.

Молекули нуклеїнових кислот ДНК і РНК зберігають у собі генетичну інформацію, необхідну для існування і розмноження живої клітини. Білки ж виступають у ролі чинного початку: молекули білків-ферментів каталізують тисячі хімічних реакцій, що протікають у клітці. Ще недавно таке «поділ праці» між інформаційними і діючими молекулами вважалося одним з основоположних принципів біохімії. Однак в останні кілька років ця схема була переглянута у зв'язку з відкриттям того, що РНК може виступати в якості ферменту.

Довгий час вважалося, що каталізаторами всіх реакцій в живій клітині служать тільки білки - ферменти. Відкриття того, що РНК може каталізувати розрізання та зшивання самої себе, тобто дозрівання, спростовує універсальність цього принципу, а також проливає світло на ранні етапи еволюції. Вивчення компонентів процесу дозрівання РНК має дуже важливе значення, так як активність генів може регулюватися не тільки в результаті зміни інтенсивності утворення РНК (транскрипції генів), але і завдяки контролю за дозріванням РНК (інформаційних, рибосомних, транспортних і ін), претерпевающих в ядрі складні перетворення. Стає очевидним, що дивна на перший погляд переривчаста структура генів не тільки забезпечує тонку регуляцію їхньої активності, але і сприяє економному, ефективному використанню інформації, закодованої у нуклеотидної послідовності ДНК.


^ РНК - фермент.

Каталітична активність РНК була відкрита в 1981 - 1982 рр.., Коли Томас Р. Чек і його колеги вивчали РНК з одноклітинного організму Tetrahymena thermophila, ставиться до типу найпростіших. До свого здивування, вони виявили, що ця РНК може каталізувати розрізання та сплайсинг самої себе, в результаті чого з неї вищепляются невеликий фрагмент. Якщо забути, що РНК не білок, РНК тетрахімени задовольняє класичним визначенням ферменту. Від «справжніх» ферментів вона відрізняється тільки тим, що білки-ферменти каталізують реакції, що протікають між іншими молекулами, в той час як ця РНК каталізує власні метаморфози. Тому для ферментоподобних молекул РНК був запропонований термін «Рибозим» (від англ. RIBOnucleic enZYME).

Чому в біологічних системах настільки необхідні каталізатори? Потреба в них виникає в основному з властивостей хімічних сполук, складових живий організм. Молекули, які беруть участь у клітинних процесах, зазвичай відносно стабільні і без впливу ззовні неохоче вступають в хімічні реакції. Ферменти прискорюють ці реакції, так що вони здійснюються за часи, співмірні з часом життя клітини. Зауважимо, що з такою роботою білки справляються чудово. Зазвичай білковий фермент прискорює каталізуються їм реакцію в 10 6 - 10 12 разів; причому білки є істинними каталізаторами: після завершення реакції білковий фермент залишається в тій же формі, в якій вступив до неї.

В общем-то зрозуміло, чому уявлення про те, що будь-який фермент є білком, міцно утвердилася в умах учених, що вивчають клітку. За десятиліття, що минули після того, як в 1926 р. Дж. Самнер з Корнеллського університету вперше виділив у чистому вигляді фермент - уреазу, що бере участь у розщепленні сечовини, сотні ферментів були отримані в індивідуальному вигляді. І у всіх випадках фермент опинявся білком - ланцюжком амінокислот, згорнутої в просторі певним чином. У ході досліджень ферментів багато чого стало відомо про їх дію. Було виявлено, що кожен фермент каталізує тільки одну біохімічну реакцію або групу дуже схожих реакції. Така виняткова специфічність забезпечується просторової укладанням амінокислотної ланцюга, що надає білку тривимірну структуру, необхідну для участі в даному хімічній взаємодії.

У 30 - 40-ті роки активно вивчалася «ферментативна» сторона життя клітини, а вивчення інформаційного аспекту в той час сильно відставало. Перший успіх в цій області прийшов у 1944 р., коли О. Ейвері і його колегам з Рокфеллерівського інституту медичних досліджень вдалося показати, що ДНК здатна передавати генетичну інформацію. Наступним великим досягненням було встановлення структури ДНК (це зробили в 1953 р. Дж. Уотсон і Ф. Крик).

Незабаром після того, як стали зрозумілими структура і значення ДНК, з'ясувалося, що РНК виконує ключові функції в передачі генетичної інформації від ДНК до білка. Спочатку послідовність нуклеотидів ДНК копіюється, що здійснюється в процесі транскрипції; внаслідок цього синтезується матрична РНК (мРНК), послідовність нуклеотидів якої відповідає вихідної ДНК. Матрична РНК зв'язується з рибосомою, де на ній, як по програмі, збирається молекула білка.

Передача генетичної інформації - тільки одна з функцій РНК. До складу самої рибосоми також входить кілька молекул РНК (рРНК). Інші невеликі молекули РНК, які називаються транспортними (тРНК), беруть участь у приєднанні в потрібному порядку амінокислот до ланцюга білка. В кінці 70-х років роль мРНК, рРНК і тРНК була вже давно відома і здавалося, що у РНК не залишилося більше ніяких таємниць. Але це лише здавалося.

^

«Розірвані гени». Дозрівання мРНК.


У 1977 р., на подив усього наукового світу, та й до свого власного, дві групи дослідників - Ф. Шарп з колегами в Массачусетському технологічному інституті і група співробітників Колд-Спрінг-Харборської лабораторії - відкрили, що у вищих організмів гени «розірвані» . Виявилося, що кодують білок послідовності перериваються вставками, які не кодують білок і при дозріванні молекули видаляються з попередника РНК. Ці ділянки були названі інтрони. Ділянки РНК, ковалентно з'єднуються один з одним і що зберігаються у складі зрілої РНК, називають екзонів. Зріла інформаційна РНК, що містить екзонів, транслюється в цитоплазмі з участю рибосом. Виявилося, що екзонів-інтронна структура генів еукаріот є скоріше правилом, а гени без інтронів - нечисленними винятками. Гени бактерій зазвичай не містять екзонів. Екзонів включають послідовність нуклеотидів, що містить наступні один за одним кодони (нуклеотидні триплети), що визначають положення амінокислот у білку. Молекули РНК, як і комплементарні нитки подвійної спіралі ДНК, полярні, розрізняють 5'-і 3'-кінці молекули. Ділянки екзонів або навіть окремі цілі екзонів, що розташовуються на 5'-і 3'-кінцях молекули інформаційної РНК, можуть не використовуватися при трансляції, вони не кодують амінокислоти.

У процесі дозрівання (процесингу) мРНК проходить наступні етапи:

1) кепірованіе - хімічна модифікація 5'-кінцевий послідовності мРНК, в результаті якої відбувається навішування спеціальної нуклеотидної структури - "шапочки";

2) сплайсинг (від англ. To splice - з'єднувати кінці) - видалення некодирующих інтронів послідовностей з мРНК і зшивання екзонів. РНК-попередник може містити один-два або десятки інтронів, розміри яких сильно варіюють (від 50 до кількох тисяч нуклеотидів). В результаті видалення інтронів РНК коротшає. Тому довжина РНК-попередника (тисячі і десятки тисяч нуклеотидів) часто в кілька разів перевершує довжину інформаційної РНК. Сплайсинг РНК відбувається в ядрі у міру освіти (транскрипції) РНК на ДНК-матриці;

3) поліаденілірованіе - хімічна модифікація 3'-кінцевий послідовності мРНК, в результаті якої відбувається приєднання до хвоста молекули залишків аденіловой (А) кислоти (рис. 1).



Рис.1. Біогенезу мРНК у еукаріотів.

У здійсненні кожного із зазначених процесов специфічне участь приймає ряд білків і нуклеїнових кислот, хоча конкретні молекулярні механізми цих перетворень ще не повністю розкриті. Всі три зазначених процесу мають важливе значення у формуванні зрілої молекули мРНК. Однак найбільший інтерес дослідники проявляють до з'ясування молекулярного механізму сплайсингу, який повинен забезпечити, по-перше, поступове і високоточне вирізання інтронів з первинного транскрипту і, по-друге, зшивання утворюються фрагментів - екзонів - «кінець в кінець». Будь-які відхилення або зсуву кордонів в процесі вирізування інтронів і зшивання екзонів навіть на один нуклеотид можуть призвести не тільки до глибокого спотворення сенсу в кодуючих послідовностях, але і до порушення передачі генетичної інформації і розвитку патології.

^ Механізм сплайсингу. Роль мяРНК.

Існує декілька різновидів сплайсингу. Найбільш поширений тип - це вирізування інтронів за допомогою комплексу білків і особливої ​​групи клітинних РНК, названих малими ядерними РНК (мяРНК). мяРНК транскрибуються за допомогою РНК-полімерази II. Виділено та охарактеризовано 5 груп багатих уридин мяРНК, відповідно позначаються U1, U2, U4, U5 і U6, розмірами від 100 до 200 нуклеотидів. Комплекси мяРНК і білків, названі малими ядерними нуклеопротеїнів (мяРНП), об'єднуються в єдину систему - сплайсосому, координуючу весь процес сплайсингу (рис.2). Ці невеликі РНК, пов'язані з білками мають ряд особливостей. Молекули мяРНК стають активними тільки після того, як вони побувають у цитоплазмі, де відбувається хімічна модифікація їх 5'-кінців, які закриваються кепом, причому на відміну від мРНК залишок гуанозіна на 5'-кінці не моно-, а тріметілірован (по N7 та двічі по N2). Крім того, мяРНК як правило містять Sm послідовність, до якої приєднується набір з семи Sm білків. Ці маркери мяРНК потрібні для спрямованого транспорту їх в ядро ​​і прикріплення до фосфорілірованний формі CTD РНК полімерази II, яка служить майданчиком для приєднання апарата дозрівання. Припускають, що мяРНК з'єднуються з обома кінцями інтрони, сприяючи формуванню специфічної конформації, необхідної для пізнавання її беруть участь у процесі ферментами, зближенню двох екзонів, видаленню інтронів і возз'єднання кодують екзонів.




Рис.2. Схема мяРНП і сплайсосоми.


Як білки і РНК, що здійснюють сплайсинг, дізнаються який фрагмент пре-мРНК потрібно вирізати? І у дріжджів і у вищих еукаріотів є консервативні послідовності, що визначають межі інтронів - GU на 5'-кінці і AG на 3'-кінці (рис. 3). Виділяють три функціонально важливих ділянки пре-мРНК, що беруть участь в сплайсинге: 5'-місце сплайсингу (5'SS), 3'-місце сплайсингу (3'SS) і місце розгалуження (BS), що містить в

нуклеотидної послідовності A (аденін), який не утворює пари з U і, отже, не входить до складу подвійної спіралі в результаті взаємодії з мяРНК. Тому цей А володіє особливою реакційною здатністю. На першій стадії 2'-гідроксил аденозину місця розгалуження атакує фосфодіефірную зв'язок 5'SS. У підсумку цієї атаки утворюється структура "ласо" і вільний 3'-гідроксил 5'-кінцевого екзонів. Під час другої стадії цей 3'-гідроксил атакує 3'SS. В результаті екзонів виявляються ковалентно з'єднаними звичайної межнуклеотидной зв'язком, а інтрон йде у вигляді структури "ласо".




Рис. 3. Нуклеотидні послідовності, що визначають межі інтронів. Схема зміни ковалентних зв'язків при вирізанні інтрони.


Як же і в якій послідовності впізнаються місця сплайсингу і розгалуження? Спочатку U1 мяРНП дізнається 5'-місце сплайсингу, а можливо і 3'-місце сплайсингу (рис. 4). Місце розгалуження впізнається білком SF1 (на малюнках у дужках представлені назви відповідних білків в дріжджах), а поліпірімідіновая послідовність, попередня 3'SS - гетеродімер U2AF. При цьому утворюється комплекс CC (commitment complex) - комплекс определяущій вирізання даного інтрони.




Рис. 4. Первинне впізнавання інтрони: освіта комплексу CC.


На наступному етапі комплекс CC переходить в комплекс A (рис. 5). Білок SF1 витісняється за допомогою UAP56 і з місцем розгалуження зв'язується U2 мяРНП. У самому U2 мяРНП фрагмент U2 мяРНК, комплементарний BS, звільняється від білка SAP61. Зв'язуванню U2 РНП допомагає білок U2AF.




Рис. 5. Освіта комплексу A: приєднання U2 мяРНП.


Після зв'язування U2 мяРНП до сплайсосоме приєднується великий рибонуклеопротеид, що містить 3 мяРНК: U4, U5 і U6 (рис. 6). В результаті утворюється комплекс B1, якому 5 молекул мяРНК. U1 мяРНК в цьому комплексі пов'язана з 5'SS, U2 - з місцем розгалуження, а U4 мяРНК пов'язана з U6 численними комплементарними взаємодіями і тим самим до пори до часу блокує активність U6 мяРНК. Всі мяРНК, крім U6 синтезуються РНК полімеразою II і мають класичні атрибути мяРНП - пов'язані Sm білки і тріметілірованний кеп. U6 мяРНК транскрибується РНК полімеразою III та не має кеп-структури. Крім того, замість Sm білків з нею пов'язані гомологічні їм Lsm білки.





Рис. 6. Освіта B1 комплексу: зв'язування U4/U5/U5 мяРНП.

Після утворення B1 комплексу відбувається найдраматичніша конформационная перебудова сплайсосоми (рис. 7). По-перше, втрачається зв'язок U1 мяРНК з 5'SS. По-друге, розплітається дуплекс між U4 і U6 мяРНК. По-третє, утворюються дуплекси між U6 мяРНК і 5'SS, а також U6 і U2 мяРНК. Найактивнішу роль у цих перебудовах відіграють білки, асоційовані з U5 мяРНК. U5-200k розплітає дуплекс між U4 і U6 мяРНК, а U5-100k допомагає утворити контакт між U6 і 5'SS. Інший білок, асоційований з U5 (U5-220k) сприяє тому, що консервативна шпилька U5 мяРНК пов'язує 5'SS і 3'SS. У результаті виявляється, що дуплекс U2 і U6 пов'язує місце розгалуження і 5'-місце сплайсингу. U5 мяРНК додатково фіксує 5'SS так, що виявляється можливим провести нуклеофільнию атаку 2'-OH випетлівающегося аденозину на Межнуклеотидная зв'язок 5'SS.



Рис. 7. Освіта комплексу B2.

Перехід від B2 комплексу до C1 якраз відповідає першій стадії сплайсингу, тобто утворенням лассообразной структури і звільненню 3'-гідроксилу 5'-кінцевого екзонів (рис.8). У самому каталітичному акті сплайсосоми беруть участь білки Spp2p і Prp2p, хоча основну роль в каталізі грають не білки, а сплайсосомная РНК.

Після проходження першої стадії сплайсингу необхідно підставити в активний центр сплайсосоми 3'SS. За вибір 3'-місця сплайсингу відповідає U5-220k білок. Цілий ряд білкових факторів відіграють роль в підстановці 3'-місця сплайсингу в активний центр. Крім того, здійснюється контроль за правильністю проведення першої стадії сплайсингу в якому бере участь білок Prp16p.





Рис. 8. Освіта комплексу C1: підстановка 3'SS в активний центр.

Особливу роль в позиціонуванні 5'-екзонів і 3'-місця сплайсингу грає U5 мяРНК. Молекула U5 мяРНК містить петлю з неспарених нуклеотидів на ніжці (стволике), де нуклеотиди утворюють пари, створюючи подвійну РНК-спіраль. Нуклеотиди петлі, взаємодіючи за рахунок водневих зв'язків з екзонів, утримують їх поблизу один від одного. Крім того, перший і останній нуклеотиди інтрони утворюють неканонічні взаємодії двох G (гуанозин). Ці взаємодії допомагають стягувати екзонів і здійснювати сплайсинг. Характер водневих зв'язків функціональних груп гуаніну відрізняється від класичних, спостережуваних в парі GC Уотсона і Крику. Так, аміногрупа G, що бере участь у встановленні комплементарних взаємодій з С, тут залишається поза грою. Друга стадія сплайсингу, що каталізується сплайсосомой полягає в атаці 3'-гідроксилу першого екзонів на Межнуклеотидная зв'язок між Інтрон і 3'-кінцевим екзонів. В результаті екзонів виявляються з'єднаними, а інтрон - вирізаним у вигляді лассообразной структури (рис.9).




Рис. 9. Освіта комплексу C2. Лігування екзонів і повне вищепленіе інтрони.





Рис. 10. Освіта комплексу I. Вивільнення інтрони і лігірованной екзонів.



Після проходження обох стадій сплайсингу стає необхідно розібрати сплайсосому, звільнити лігірованной екзонів, а також вирізаний інтрон (рис 10). мРНК вивільняє HRH1 білок. Розбиранням сплайсосоми займається білок mDEAH9. Додатковий білковий фактор (Prp24p) потрібен для відтворення U4/U6 гетеродімер. Не всі білки, що входять до складу сплайсосоми, покидають мРНК після сплайсингу. Деякі залишаються пов'язаними з мРНК в ядрі і беруть участь в експорті сплайсірованной мРНК. Інші переносяться з мРНК у цитоплазму, де здійснюють "контроль якості" мРНК при її трансляції.

На малюнку 11 схематично представлений весь цикл роботи сплайсосоми.




Рис. 11. Цикл роботи сплайсосоми.

Таким чином, сплайсинг протікає в декілька етапів: починається з взаємодії пре-мРНК з U1 мяРНК, потім утворюються ласо і складна багатокомпонентна структура. Просторова структура взаємодіючих ділянок молекул РНК забезпечує каталітичні реакції розриву одних Межнуклеотидная зв'язок і виникнення нових. В основі каталізу лежить здатність РНК утворювати описані структури, що забезпечують високу реакційну здатність певних нуклеотидів, розташованих по довжині молекул РНК. Виникнення таких структур забезпечує точність сплайсингу. У ряді випадків, наприклад у транскрипту генів клітинних органел (мітохондрій або хлоропластів), освіта складної тривимірної структури в районі інтрони забезпечує його вирізування і зшивання екзонів без участі білків. Такий процес, що не залежить від білків, називають самосплайсінга або аутосплайсінгом.

Виявлення здатності молекул РНК каталізувати власні хімічні перетворення або модифікацію (дозрівання) інших молекул РНК дозволило назвати їх рібозімамі за аналогією з ферментами (ензимами). Необхідно відзначити, що активність рибозимов сильно збільшується, коли вони знаходяться в комплексі з білками. В обох випадках успішний хід каталізу забезпечується тривимірними структурами білка або РНК-РНК-комплексу. Пошкодження цих структур зупиняє реакцію. У разі рибозимов першорядну роль грають комплементарні взаємодії нуклеотидних пар. Зауважимо, однак, що білки прискорюють взаємодії мяРНК з пре-мРНК.

У сплайсинге беруть участь білки, що володіють ферментативною активністю. Для зборки комплексу, що каталізує сплайсинг, необхідно споживання енергії у вигляді розщеплюваних молекул АТФ, тому в його складі виявляються білки, що володіють аденозінтріфосфатазную активність. Крім того, тут функціонують і РНК-ХЕЛІКАЗИ - ферменти, здатні розплітати при споживанні АТФ подвійні спіралі РНК-РНК. Ці ферменти подібні ДНК-ХЕЛІКАЗОЙ, розплітали двунітевой спіраль ДНК при реплікації молекули ДНК. ХЕЛІКАЗИ забезпечують хід сплайсингу. Вони вчасно руйнують одні РНК-РНК взаємодії (наприклад, U4 мяРНК - U6 мяРНК), сприяючи тим самим виникненню нових нековалентних зв'язків між молекулами РНК. Таким чином, послідовність подій, що ведуть до сплайсинг екзонів, досить жорстко визначена, причому кожна наступна стадія (або реакція) обумовлена ​​попередньої. Многокомпонентность машини сплайсингу дозволяє прискорювати або гальмувати процес дозрівання РНК, якщо змінювати концентрацію окремих компонентів або викликати їх хімічну модифікацію. Наприклад, спостерігали фосфорилювання білків сплайсингу, що супроводжується активацією одних і інактивацією інших білків.
^




Альтернативний регульований сплайсинг.


Виявилося, що екзонів, якщо їх декілька, можуть зшивати (сплайсірованной) в різних комбінаціях. Більш того, нуклеотидних послідовність, виступаюча як екзонів в одному випадку, веде себе як інтрон в іншому. Ці можливості вибору шляхів сплайсингу молекули РНК-попередника представлені на рис. 12.



Рис. 12. Схема альтернативного сплайсингу пре-мРНК.

Так, наприклад, ділянка екзонів 1а може вести себе як інтрон. Інший випадок демонструє утворення двох різних РНК, несучих ділянки, що кодують різні білкові структури. Так, якщо екзонів 2 кодує в молекулі білка елементи α-спіралі, а екзонів 3 - так званої β-структури, то РНК 1 буде кодувати білок, не включає зазначену ділянку β-структури, а РНК 2, навпаки, служить матрицею при утворенні білка без ділянки α-спіралі. В результаті утворюються так звані ізоформи білка. Це спостережуване для багатьох генів явище вибору шляхів дозрівання мРНК отримало назву альтернативного сплайсингу. Багато гени містять десяток і більш екзонів. Тому число варіантів зрілих молекул мРНК, що містять різні екзонів, потенційно може бути достатньо великим, наближаючись до величини 2 n, де n - число екзонів. Таким чином, екзонів-інтронна структура виявляється надзвичайно економічною, забезпечуючи велику різноманітність білків, кодованих різними мРНК, які, однак, сталися з одного і того ж РНК-попередника в результаті транскрипції одного гена.

Випадки альтернативного сплайсингу мають місце в м'язовій тканині, призводячи до утворення функціонально розрізняються, але багато в чому схожих (містять загальні екзонів!) Білків. Розглянемо конкретний приклад - тропомиозин, білок, який бере участь у м'язовому скороченні. У різних клітинах з гена тропомиозина синтезуються різні білки:




Це ж явище широко поширене в нервовій тканині, де, як відомо, транскрибується величезна безліч генів, забезпечуючи різноманітність білків. Так, наприклад, різноманітність білків оболонки нервових волокон обумовлено альтернативного сплайсингу. Альтернативний сплайсинг нерідко використовується при синтезі варіантів білків - "факторів транскрипції", необхідних для включення (або виключення) гена і роботи РНК-полімерази. Наявність білка - фактора транскрипції може визначати долю клітини, її диференціювання в клітку спеціалізованої тканини: нервовою, жировою, ниркової і т.д. Альтернативний сплайсинг виконує свою роль і при утворенні варіантів білків клітинної адгезії, які відповідають за пересування клітин і структурування тканин. Бактерії, що володіють, як правило, генами без інтронів, позбавлені цього способу регуляції роботи (експресії) генів.

Яким чином здійснюється вибір шляху альтернативного сплайсингу, що є важливим механізмом регуляції активності генів і клітинної диференціювання? Характер сплайсингу регулюється білками, здатними зв'язуватися з молекулою РНК в районах інтронів або прикордонних ділянках екзонів-інтрон. Такі білки можуть блокувати видалення одних інтронів, в той же час активуючи вирізання інших. РНК-попередник складається в складну тривимірну структуру, взаємодіючи з іншими компонентами сплайсосоми. Тому неважко уявити собі такі просторові зміни цієї структури за участю білків, що регулюють сплайсинг, які виключать каталіз об'єднання однієї пари інтронів і, навпаки, будуть ефективно сприяти зшиванню іншої пари.

Спрямована регуляція шляхів сплайсингу може мати величезні біологічні наслідки, наприклад визначати стать організму. Випадок визначення статі, заснований на регуляції сплайсингу, досить добре вивчений у плодової мушки дрозофіли (рис.13). Успіхи цих досліджень засновані на роботах генетиків, які вивчали мутації, що порушують становлення статі. Величезну роль тут відіграли також роботи, в яких в експериментах in vitro були використані "клоновані гени" (рекомбінантні ДНК).



Рис.13. Регульований каскад наступних один за одним альтернативних шляхів сплайсингу визначає становлення підлоги на самих ранніх стадіях розвитку дрозофіли. Пряма і хвилеподібна стрілки позначають відповідно початок і кінець трансляції (утворення білка). Екзонів, специфічні для самців, виділені рожевим кольором.

У дрозофіли (втім, як і у людини) є дві статеві хромосоми (X і Y). Дві X-хромосоми мають самки, тоді як самці - єдину X-хромосому, а також Y-хромосому. Наявність двох X-хромосом у самок достатньо для включення "головного гена", що змушує включитися "нижележащие" гени, що беруть участь у визначенні статі. Головний ген (рис. 13) спочатку починає працювати (транскрибувати) тільки у самок з двома Х-хромосомами. У клітці спрацьовують механізми, підраховують число Х-хромосом. Цей механізм заснований на тому, що у самок з двома Х-хромосомами утвориться достатня кількість білка, кодованого генами Х-хромосоми, який активує промотор головного гена. Транскрипція головного гена починається з промотору 1 (на рис. 13 не показаний). У самців з одного Х-хромосомою кількість білка недостатньо, щоб запустити головний ген. В результаті сплайсингу транскрипту головного гена утворюється РНК 1, що містить екзонів 1, 4, 5, 6, 7 і 8. У цьому випадку потенційні екзонів 2 і 3 не входять до складу мРНК. Ці події відбуваються на самих ранніх стадіях розвитку ембріона. Трохи пізніше ген 1 починає транскрибувати як у самок, так і у самців з використанням іншого промотора 2, лежачого лівіше. У цьому випадку 5'-кінець РНК-попередника буде подовжений, в результаті чого екзонів 1 сплайсіруется іншим шляхом і стає коротшим в РНК 1а і 1б в порівнянні з РНК 1. Білок 1, що утворюється при трансляції РНК 1, є регуляторним білком сплайсингу, відсутнім у самців. Цей білок направляє сплайсинг у самок з утворенням зрілої РНК 1а, що містить фрагмент екзонів 1, до якого пришиваються наступні екзонів: 2-4-5-6-7-8. Білок, що визначає такий характер альтернативного сплайсингу, відсутня у самців. У результаті в ядрах клітин розвивається ембріона, що володіє тільки однією Х-хромосомою, попередник РНК дозріває з утворенням РНК 1б, що включає екзонів 3.

Регуляторний білок 1 сплайсингу, що утворився у самок на РНК1, дозволяє машині сплайсингу "впізнавати" в клітинах самок екзонів 3 як інтрон і видаляти його з утворенням РНК1 і РНК1а. Виявляється, екзонів 3 містить так званий стоп-кодон, який не кодує амінокислоти і зупиняє зростання поліпептидного ланцюга білкової молекули. В результаті синтез білка на РНК 1б якщо і почнеться, то швидко обірветься з утворенням дуже короткого, распадающегося білкового фрагмента. Таким чином, "самцового" тип сплайсингу призводить фактично до інактивації гена, оскільки ген не здатний кодувати освіту функціонуючої білкової молекули. Отже, результатом альтернативного сплайсингу може бути не тільки освіта ізоформ білків, кодованих одним геном, але і інактивація гена ("головного гена" у самців). Білок 2, що утворюється у самок, не тільки постійно спрямовує хід сплайсингу з утворенням РНК 1а, але і регулює дозрівання РНК 2, що містить екзонів 1-2-3. Ця РНК 2 утворюється вже на іншому гені, який входить у систему генів визначення статі у дрозофіли. У самців утворюється дещо інший варіант РНК 2 - РНК 2а, що включає декілька збільшений екзонів 2. Цей фрагмент екзонів у самок впізнається як інтрон. Знову "самцовая" частина екзонів 2 містить стоп-кодон, який зупиняє трансляцію, тоді як у самок утворюється активний білок 3, що приводить до утворення РНК 3, що включає екзонів 1-2-3-4. При відсутності білка 3 попередник РНК 3 в ядрах клітин самців "сплайсіруется" таким чином, що послідовність, що відповідає екзонів 4 самок, виглядає як інтрон, а до екзонів 3 пришиваються екзонів 5 і 6. На цей раз РНК 3а (екзонів 1-2-3-5-6) у самців, кодована геном "подвійна підлога", не містить шкідливих стоп-кодонів, вона кодує функціональний білок. Мішенями дії регуляторних білків, синтезованих на матричних РНК 3 і 3а, є гени, подальша робота яких повністю виключає відповідно розвиток самця або самки (рис. 13). Відзначимо, що, незважаючи на варіації в характері сплайсингу, завжди по краях інтронів повинні перебувати згадані вище канонічні нуклеотидні послідовності, використовувані при каталізі того чи іншого шляху сплайсингу. Ми простежили каскад регульованих подій альтернативного сплайсингу. У самців він двічі приводив до утворення дефектної мРНК, не здатної кодувати достатньо довгий і функціонуючий білок. У самок спостерігається послідовне, поетапне утворення матриць РНК для кодування білка, регулюючого транскрипцію і / або хід подій альтернативного сплайсингу.

Приклади альтернативного сплайсингу новоутвореної РНК показують, як в кінцевому рахунку окупаються витрати, в тому числі енергетичні, що йдуть на синтез надлишку ділянок РНК, які потім видаляються і не використовуються для синтезу білка. Альтернативний сплайсинг забезпечує регуляцію роботи гена, диференціювання тканин і розвиток організму. Однак біологічна роль переривчастою екзонів-інтронів структури генів і роль інтронів послідовностей на цьому не закінчується. Нещодавно було виявлено, що вирізаються інтрони можуть бути попередниками особливих малих ядерних РНК, що беруть участь у дозріванні рРНК.


^




Дозрівання рРНК. мяоРНК.


Хвороби синтезуються у вигляді великого попередника. Цей попередник нарізається на зрілі молекули рРНК за допомогою ендо-та екзонуклеаз. Крім того, окремі нуклеотиди рРНК модифікуються.

Попередник рРНК прокаріотів містить фрагменти, відповідні 16S, 23S і 5S рРНК. Як правило, в цьому транскрипт містяться також кілька пре-тРНК. Великі рибосомальні РНК утворюють домени подібного транскрипту. Їх 5 'і 3'-кінці зближені за рахунок комплементарності прилеглих ділянок РНК. Така дволанцюжкова структура розрізається РНКази III, а що залишилися кілька зайвих нуклеотидів відрізаються екзонуклеазамі. Модифікація підстав рРНК проводиться набором ферментів, причому один фермент може модифікувати від 1 до 3 нуклеотидних залишків.





Рис.14. Схема процесу розрізання попередника рРНК еукаріот.



У еукаріотів дозрівання також включає в себе розрізання попередника (рис. 14), причому крім 18S, 28S, і 5S рРНК з'являється ще й 5.8S рРНК. Крім різних ендо-і екзонуклеаз, в дозріванні беруть участь малі ядерцеві РНК (мяоРНК). Ці РНК локалізовані переважно в полісом - ділянці ядра, де відбувається транскрипція генів рРНК і збірка пре-рибосом.

Якщо нарізування попередника рРНК, загалом, схоже у про-і еукаріотів, то система модифікації підстав рРНК у еукаріотів унікальна. На відміну від прокаріотів, у вищих організмів модифіковано набагато більше нуклеотидних залишків рРНК. Серед модифікацій переважна більшість це псевдоуріділірованіе і 2'-O-метилування рибози. Неможливо уявити, щоб модифікації всіх цих залишків здійснювалися кожна своїм ферментом.

Виявилося, що в полісом, крім мяоРНК, що беруть участь в розрізанні пре-рРНК, існує безліч інших мяоРНК. Ці невеликі РНК можна розділити на 2 класи: C / D і H / ACA (рис. 15).





Рис. 15. Властивості мяоРНК різних класів.



МяоРНК обох класів транскрибуються РНК пролімеразой II, але не як самостійні гени, а в інтрони інших генів. Часто мяоРНК входять до складу інтронів мРНК рибосомних білків. Є випадки, коли єдиною функцією деяких генів служить виробництво мяоРНК, що містяться в інтрони. При цьому відкрита рамка зчитування зрілої мРНК перервана численними стоп-кодонами і не кодує якого-небудь білкового продукту.

Характерна особливість мяоРНК - короткі ділянки комплементарності різних областей рРНК. У РНК C / D класу ця область комплементарності більше 10 нуклеотидів, а у H / ACA - менше. З кожним класом мяоРНК пов'язаний свій набір білків. мяоРНП C / D класу здійснюють 2'-O-метилування, а H / ACA - псевдоуріділірованіе рРНК.

Структура мяоРНК представлена ​​на малюнку 17. 5'-і 3'-кінці C / D мяоРНК спарені. Слідом розташовані дві консервативні послідовності нуклеотидів, через які цей клас і отримав свою назву. Відразу за D послідовністю йде ділянку комплементарності рРНК. Третій нуклеотид рРНК від ділянки почала комплементарності 2'-O-метіліруется. У H / ACA мяоРНК також є дві консервативні послідовності, що дали назву цьому класу. Нуклеотиди, комплементарні рРНК розташовуються в двох внутрішніх шпильках. Залишок уридину в положенні, зазначеному на малюнку 16, ізомеризується в псевдоуридин.





Рис. 16. Модель структури комплексів мяоРНК-рРНК, в яких відбувається модифікація нуклеотидів.



За допомогою мяоРНК еукаріотичні організми вирішують проблему специфічною модифікації залишків рРНК, без залучення величезної кількості специфічних ферментів. До речі, малі РНК, подібні мяоРНК беруть участь в модифікації малих ядерних РНК.


^

Дозрівання тРНК


Попередник тРНК містить додатковий фрагмент на 5'-кінці (рис. 17). Цей фрагмент відрізається РНКази P - рибонуклепротеіну, основну каталітичну роль в якому грає РНК. РНК-компонент РНКази P це Рибозим. Білок (або, у випадку еукаріотів, білки) в РНКази P грає лише структурну роль. Також, як і для інших рибозимов, РНК РНКази P має сильну вторинну структуру. У бактеріальної РНКази P є ділянка, комплементарний CCA кінця тРНК. Еукаріотичних РНКаза P дізнається інші елементи попередника тРНК.





Рис. 17. Модель вторинної та третинної структур бактеріальної РНКази P і її субстрат - попередник тРНК.


Формуванням 3'-кінця молекули тРНК займаються кілька білків - РНКази. Крім того, особливий фермент - тРНК нуклеотіділтрансфераза добудовує CCA хвіст тРНК, якщо він був втрачений. У еукаріотів CCA послідовність взагалі не кодується в генах тРНК, а додається пост-транскрипційно.


В тРНК еукаріотів, наприклад дріжджів, є інтрони. У відмінності від інтронів, що зустрічаються в мРНК, вони не обмежені будь-якими консервативними послідовностями і вбудовані в строго певну ділянку тРНК - антикодоновой петлю (рис. 18).





Рис. 18. Сплайсинг пре-тРНК дріжджів.



Попередник тРНК має в районі антикодоновой шпильки симетричну структуру, дізнавшись димер специфічної ендонуклеази. Ця Нуклеази вирізає інтрон, залишаючи фосфат на 3'-кінці 5'-кінцевого фрагмента. Для успішного лігування фрагментів тРНК, необхідний 3'-гідроксил і 5'-фосфат. Щоб досягти цього, ферменти, здійснюють сплайсинг тРНК, спочатку переносять фосфат з 3'-положення на 2 '. Потім проводиться фосфорилювання 5'-гідроксилу. Після лігування утворюється ковалентно замкнута тРНК, що містить додатковий фосфат, приєднаний до 2'-OH. Він віддаляється фосфатазою.


Висновок.

У висновку хотілося б виділити основні положення, які показав аналіз літературних даних.

  1. Головною функцією мяРНК є участь у процесі "дозрівання" клітинних РНК.

  2. Процес «дозрівання» клітинних РНК супроводжується хімічними модифікаціями РНК-попередника і укороченням його розмірів. Дозрівання являє собою регульований багатостадійний шлях, по ходу якого здійснюється взаємодія новоствореного попередника РНК з білками і іншими РНК, що забезпечують в кінці кінців утворення функціонально активної молекули РНК. Регуляція процесу дозрівання РНК - це спосіб регуляції активності гена, що кодує дану молекулу РНК.

  3. При дозріванні інформаційної РНК має місце каталітичний процес видалення з РНК інтронів та об'єднання екзонів, які кодують окремі ділянки білка. Сукупність цих хімічних реакцій носить назву сплайсингу. Сплайсинг проходить в спеціальній внутрішньоядерної багатокомпонентної структурі - сплайсосоме, що включає десятки білків і набір так званих малих ядерних РНК, забезпечують сплайсинг.

  4. Молекулярний механізм сплайсингу здійснюється завдяки комплементарним взаємодіям нуклеотидів РНК-попередника і малих ядерних РНК. Ці взаємодії відіграють першорядну роль в каталізі сплайсингу. Утворені складні структури визначають точність сплайсингу. Крім того, велика роль білків, здатних специфічно "дізнаватися" не тільки ділянки РНК, але й один одного. Сплайсинг визначається послідовними впорядкованими взаємодіями компонентів машини сплайсингу з попередниками РНК. Дослідження молекулярних механізмів сплайсингу показує, що каталітична активність, визначальна видалення інтронів та об'єднання екзонів, може мати місце і при відсутності білків, тобто визначатися взаємодіями ділянок РНК, що призводять як до розриву, так і до возз'єднання межнуклеотидной зв'язку. Порушення точності сплайсингу при утворенні інформаційних РНК, викликане мутацією, може перешкоджати трансляції та утворення білка.

  5. Многокомпонентность машини сплайсингу дозволяє регулювати освіту мРНК за рахунок зміни концентрацій окремих компонентів або хімічної модифікації, яка змінює біологічну активність молекул, що визначають сплайсинг.

  6. Зміна характеру сплайсингу екзонів в різних тканинах одного і того ж РНК-попередника може призводити до утворення різних РНК, що містять різні набори екзонів (альтернативний сплайсинг). В результаті РНК, транскрібіруемие з одного гена, будуть кодувати білки з різними властивостями. Вибір шляхів сплайсингу РНК-попередника - це спосіб регуляції активності генів у різних клітинах і тканинах організму.



Список використаної літератури.

  1. Гвоздьов В.А. Механізми регуляції активності генів в процесі транскрипції / / Соросівський Освітній Журнал. 1996. № 2. С. 22-31.

  2. Велц Р., Шмідт К., Мюллер С. Моделювання та синтез рибозимов / / Молекулярна біологія - 2000 - т.34 - вип.6 - с.1090-1095

  3. Звєрєва М.Е., Шпанченко О.В. Структура та функції тмРНК (10Sa РНК) / / Молекулярна біологія - 2000 - т.34 - вип.6 - с. 1081-1088

  4. Кленів М.С., Гвоздьов В.А. Формування гетерохроматину: ролькороткіх РНК і метилування ДНК / / Біохімія - 2005 - т.70 - Вип.11 - с.1445

  5. Таємниці маленьких РНК / / Навколо світу - 2007 - № 3

  6. Лекції, представлені на сайті кафедри хімії природних сполук МГУ. Сергієв П.В. Процесинг. 2002 р. http://nature.chem.msu.su/study_lectures_editing_lectureonline_ru.html

  7. Томас Р. Чек РНК - фермент / / Світ науки. 1987 № 1
Навчальний матеріал
© uadoc.zavantag.com
При копіюванні вкажіть посилання.
звернутися до адміністрації